精读分享│【Nature communications】：人顶端外翻型鼻类器官揭示了基质金属蛋白酶在气道上皮分化中的关键作用
英文题目：Human apical-out nasal organoids reveal an essential role of matrix metalloproteinases in airway epithelial differentiation
中文题目：人顶端外翻型鼻类器官揭示了基质金属蛋白酶在气道上皮分化中的关键作用
期刊：Nature communications（IF: 16.6）
单位：中山大学附属第一医院
发表时间：2024年1月
摘要：
细胞外基质（ECM）的组装/分解是调节气道上皮发育和重塑的关键因素。气道类器官广泛应用于呼吸道研究，但很少有研究使用体外类器官系统来表明ECM组织在上皮生长和分化中的作用和机制。目前大多数基于Matrigel的气道类器官都是基底向外的方向，难以接近顶端表面。我们提出了一种使用生物化学定义的混合水凝胶系统的人顶端外翻型气道类器官。在人鼻上皮祖细胞（hNEPCs）分化期间，凝胶逐渐降解，导致类器官顶端表面朝外。ECM降解酶、基质金属蛋白酶（MMPs，如MMP7、MMP9、MMP10和MMP13）的表达和活性在类器官分化期间增加，抑制MMPs则显著抑制正常纤毛活动，导致杯状细胞比例增加。此外，在炎性粘膜的杯状细胞增生上皮中发现MMPs减少。该鼻类器官系统揭示了上皮源性MMPs在上皮细胞分化中的重要作用，并为进一步研究ECM在健康状态下和疾病中调节气道发育提供了一个可应用的平台。
结果：
1．基于CAH凝胶的人顶端外翻型鼻类器官的建立(hANOs)
①收集慢性鼻-鼻窦炎（CRS）患者的鼻粘膜标本，通过组织样品的机械破碎和酶解离分离上皮细胞。我们设计了一种含有I型胶原蛋白（C）、藻酸盐（A）和透明质酸（H）的混合CAH凝胶，结合hNEPC培养条件建立了鼻类器官系统。
②增殖阶段：在CAH凝胶中的hNEPC在随机方向上增殖和延伸，从第5天到第10天形成3D分叉状结构（图1A）；分化阶段：一旦类器官达到一定密度，将培养基改为分化培养基，从第11天到第17天，基质水凝胶部分降解，鼻类器官逐渐转变为球形形态（图1A）；从第18天到第24天，不同的类器官球通过基底细胞融合成更大的上皮结构（图1A），而分化细胞（纤毛或杯状细胞）位于类器官表面，出现丰富的跳动纤毛。
③上皮分化过程中各类细胞比例变化
3D免疫荧光图像显示，在增殖阶段，主要细胞类型属于基底细胞（p63+细胞）（图1A）。在分化阶段，杯状细胞（MUC5AC+分泌细胞）在第17天左右首次出现，纤毛细胞（βIV-微管蛋白+或FOXJ1+）在第24天左右明显出现，同时在这个阶段p63+基底细胞减少（图1A，B）。在分化阶段，类器官也形成了顶端紧密连接，如紧密连接蛋白（ZO-1）（图1B）；类器官边缘的纤毛结构蛋白(βIV-微管蛋白)染色清楚地揭示了类器官的顶端面向外，因此我们称它们为人顶端外翻型鼻类器官。
④发现CAH凝胶在增殖阶段(直到第10天)可以保持其完整性；随着分化的进行，凝胶逐渐降解（图1C）。通过使用胶原杂交肽(F-CHP)的荧光探针，发现与增殖的hANOs（第10天）相比，分化的hANOs（第24天）中F-CHP的信号显著增强（图1C，D）。
Fig. 1 Characterization of hANOs during epithelial differentiation.
2．通过使用刷拭技术从鼻粘膜收集上皮细胞来建立hANO
为了测试CAH凝胶培养系统对其他来源上皮细胞的适用性，我们使用鼻部刷拭技术从CRS患者（n = 2）和对照受试者（n = 2）的中鼻甲收集了鼻上皮细胞。发现增殖阶段的细胞呈分叉状生长；在分化阶段，凝胶被降解，类器官变成类球体形态，跳动的纤毛朝外（补充图4）。因此，我们证实了通过使用微创方法收集的上皮细胞也可以建立hANOs。
Supplementary Figure 4. Bright field microscopic views of hANOs during proliferation and differentiation time points.
3. hANOs在分化过程中的分子特征和特性
为了检测hANOs发育过程中基因表达谱的变化，在三个不同的时间点进行了RNA-seq分析：增殖结束（第10天）、分化阶段（第17天）和分化阶段（第24天）。
①分析了hANOs在三个分化阶段的差异表达基因。与第10天相比，第24天hANOs中有3251个上调基因和2082个下调基因（图2C）。
②GO分析、GSEA和KEGG分析显示在定义相关生物学过程的前10个条目中，大多数与纤毛形成（例如纤毛组织、纤毛组装等）、细胞周期调节（例如核分裂、DNA复制等）有关，而两类与ECM组装（细胞外基质组织、细胞外结构组织）有关（图2D）。
③KEGG分析显示，与细胞周期、ECM-受体相互作用、Rap1信号传导相关的途径参与了整个分化过程，而MAPK信号传导和钙信号传导与完全分化阶段相关（图2D）。
④GSEA结果表明，在早期分化期间（第17天对第10天），有丝分裂姐妹染色单体分离、细胞周期检查点和细胞周期相关的功能活性显著降低（图2D）；而当hANOs完全分化时，纤毛运动、轴丝组装和纤毛组织的活动显著增强。
⑤有趣的是，涉及基质金属蛋白酶家族成员的胶原分解代谢过程在分化过程中被显著激活(图2D)。在器官样分化之后，观察到细胞增殖相关基因(TP63、NOTCH1、MKI67、MYC)减少，与气道上皮细胞分化相关的基因(FOXJ1、TP73、ALDH1A1、KRT8)增加(图2E)。
总的来说，RNA-seq结果表明了细胞周期和纤毛发生在hANOs分化阶段的作用。此外，数据表明，与细胞外基质组装和胶原分解代谢过程相关的功能活动可能有助于上皮分化过程中CAH凝胶的降解表型。
Fig. 2 Molecular characteristics of hANO development.
4．hANOs模型与气液界面模型(ALI)中鼻上皮细胞分化的分子特征比较
ALI是诱导气道上皮分化的常用模型。与hANOs类似，在增殖结束时（第7天）、分化阶段（第14天）和分化阶段（第21天）进行RNA-seq实验。
①与增殖期相比，分化阶段（第14天）和分化阶段（第21天）分别有5434和7801个差异表达基因。GO分析显示了分化进程中显著的纤毛形成相关功能（补充图5）。
②比较了hANO和ALI模型之间上皮发育的相似性。结果显示，在两个分化阶段，这两个模型的重叠差异基因分别为4541(占总差异表达基因的82%)和7025(占总差异表达基因的88%)(补充图5)。
③hANO和ALI系统都显示上皮分化过程中ECM相关基因群在增殖和分化状态下以相似的趋势显著变化(补充图5)。
上述发现显示了当前hANOs和传统ALI模型之间上皮细胞的相似分子特征，表明生物功能(如ECM组装/分解)的存在不是这种CAH凝胶系统中培养的人工产物。
Supplementary Figure 5 Comparison of molecular characteristics between hANO and ALI model.
5. hANOs分化过程中MMP（MMP 7、MMP9、MMP10和MMP13）的表达和活性增加
基质金属蛋白酶MMP负责降解组织中的ECM成分（包括胶原），我们假设当前CAH凝胶系统的降解可归因于鼻上皮细胞在分化过程中产生的某些MMP。
①在RNA-seq分析的基础上，发现分化过程中具有显著上调的MMP成员，包括MMP7、MMP9、MMP10和MMP13(图3A)。我们进一步验证了它们的mRNA和蛋白表达水平。与增殖期结束(第10天)相比，MMP7、MMP9、MMP10和MMP13的mRNA水平在分化期(第17天)和分化期(第24天)显著上调(图3B)。
②在分化过程中（第24天或第17天VS第10天），在hANOs的上清液中MMP7、MMP9、MMP10和MMP13蛋白水平也显著增加（图3C）。与分化的hANOs（第24天）相比，分化状态的hANOs（第17天）的总MMPs具有显著较低的蛋白酶水解活性（图3D）。上述结果表明，上皮来源的MMP7、MMP9、MMP10和MMP13参与了hANOs分化过程中胶原凝胶的降解。
③MMP基因表达也在其他气道上皮培养系统中得到验证，包括ALI和Matrigel模型。随着分化的进展，MMP7、MMP9、MMP10和MMP13的mRNA水平在ALI中显著上调；而除MMP7外，其他三个MMP基因在Matrigel模型中均呈上调趋势（补充图6）。这些发现表明在分化期间气道上皮细胞中MMP基因的产生是一种普遍现象，它不是由当前的水凝胶条件诱导的。
Fig. 3 Expression and activity ofMMPs during hANO development.
Supplementary Figure 6 mRNA levels of MMP7, MMP9, MMP10, and MMP13 were analyzed in ALI (A) and Matrigel model (B) at proliferation (D7) and differentiation (D21) stages by qPCR assays.
6.上皮源性MMP活性是正常粘液纤毛分化所必需的
①为了确定hANO分化是否依赖于MMP蛋白酶活性，从第10天开始加入MMP抑制剂actinonin（放线菌素）。在分化阶段（第17天）和分化阶段（第24天）用放线菌素处理的hANOs中MMP活性显著降低（图4A）。
②MMP抑制剂处理的hANOs在分化期（从第11天到第17天）显示出较少的球状体类形（补充图7）；在第24天，尽管放线菌素处理的和未处理的类器官都显示出类似大小的合并球体，但在放线菌素处理的类器官中观察到较少的跳动纤毛（补充图7）。
③通过评估纤毛细胞和杯状细胞的百分比以及Foxj1和MUC5AC的表达水平，发现用放线菌素处理的hANOs显示纤毛形成显著减少；然而，这些hANOs显示杯状细胞比例增加（图4B-D）。
④用MMP抑制剂处理的类器官显示出胶原蛋白的延迟降解，如CHP（胶原杂交肽的荧光探针）数据所示（图4E–G）。
上述结果表明抑制MMP活性可以减少类器官的纤毛，并导致异常分化表型，即杯状细胞数量的相对增加。
⑤RNA-seq分析进一步分析了经MMP抑制剂处理的hANOs与未经处理的hANOs的分子谱。与第17天和第24天的未处理组相比，用MMP抑制剂处理的hANOs中分别有468个差异基因（129个上调，339个下调）和1766个差异基因（438个上调，1328个下调）（图5C）。
⑥GO分析显示与未处理的相比，在MMP抑制剂处理的hANOs中，这些基因在纤毛形成相关功能类别中最富集；GSEA分析显示纤毛组装活性降低、细胞外基质组装活性增强；此外，在分化阶段（第24天），在MMP抑制剂处理的类器官中宿主防御反应和Wnt信号通路的功能被激活（图5D）。
⑦在放线菌素处理的hANOs与未处理的hANOs相比，标志性纤毛形成相关基因显著下调，如FOXJ1、DNAAF1、DNAH5、DNAH12和TUBB4B，但有助于杯状细胞分化或粘液功能的基因显著上调，如SPDEF、IL-13、FOXA3、MUC5AC和MUC5B(图5E)。
因此，用MMP抑制剂处理的hANOs的分子特征表明纤毛形成受到抑制，但粘液分泌细胞也得到增强。
Fig. 4 Characterization of hANOs treated with MMP inhibitor.
Supplementary Figure 7 Bright field microscopic views of hANOs treated with and without actinonin during differentiation stages.
Fig. 5 Molecular characteristics of hANOs treated with actinonin.
7. 在ALI和apical-in类器官模型中，气道上皮的纤毛活动依赖于MMP活性
为了验证hANOs的上述发现，我们进一步研究了MMPs在ALI和Matrigel系统中对鼻上皮纤毛形成的作用。
当从分化开始在ALI和Matrigel模型的细胞中应用MMP抑制剂时，纤毛细胞的比例以及标记基因FOXJ1显著降低；杯状细胞的百分比似乎没有变化(补充图8)。总之，这些结果证实了MMP在气道纤毛化过程中的重要作用，并强调了正常的气道上皮分化依赖于MMP活性。
Supplementary Figure 8 Characterization of ALI cultures and Matrigel-based apical-in organoids treated with MMP inhibitor.
8. 慢性炎症鼻粘膜杯状细胞增生中基质金属蛋白酶的下调
为了检测上皮源性MMP是否参与气道粘膜上皮重塑，我们评估正常上皮(来自对照组)与杯状细胞增生上皮(来自CRS患者)中MMP7、MMP9、MMP10和MMP13的表达水平。
①Masson染色结果显示，主要由胶原组成的上皮下的基底膜在杯状细胞增生上皮中比在正常上皮中更厚(图6)，表明胶原沉积的增加可能与异常的上皮重塑有关。
②MMP蛋白的染色证明MMP7、MMP9、MMP10和MMP13主要位于正常上皮的纤毛细胞和一些基底细胞中(图6)，而在杯状细胞化生的上皮中，MMP7、MMP9和MMP13的表达水平显著下调（图6），MMP10似乎普遍表达于正常和化生上皮中（图6）。除了上皮区域，这些MMP蛋白也定位于上皮下区域的某些类型的免疫细胞中（图6）。
总之，体内组织中上皮来源的MMP表达模式显示出与hANO模型中观察到的类似变化，并支持体外研究结果，即MMP（MMP 7、MMP9和MMP13）表达的上调与气道上皮纤毛形成有关，但抑制MMPs可能导致异常分化模式，即杯状细胞数量增加。
Fig. 6 Evaluation of basement membrane and MMP expression in normal epithelium and epithelium with goblet cell hyperplasia in nasal mucosa.
9.特定的基质金属蛋白酶对纤毛细胞的分化至关重要
我们进一步阐明hANOs的粘液纤毛发育可能归因于特定的MMP。我们分别选择了MMP9和MMP13的抑制剂，以及MMP7和MMP10的中和抗体。
①用MMP13抑制剂处理的CAH凝胶降解的程度与未处理的相当；而用MMP9抑制剂和MMP7或MMP10的中和抗体处理显示出比未处理的更少的凝胶降解(图7A)。
②免疫荧光染色显示，与未处理的或用MMP13抑制剂处理的类器官相比，用MMP9抑制剂和MMP7或MMP10的中和抗体处理的类器官显著降低了类器官分化成纤毛细胞的能力(图7B-D)。
③与未处理的类器官比，用MMP9抑制剂处理的类器官显示杯状细胞百分比增加，但用MMP13抑制剂、MMP7或MMP10的中和抗体处理的类器官对杯状细胞分化没有显著影响(图7B-D)。
④定量PCR显示与未处理的类器官相比，MMP9抑制剂处理的类器官、MMP7或MMP10中和抗体处理的类器官中纤毛细胞标记基因(FOXJ1)的下调；而由杯状细胞产生的粘蛋白基因(MUC5AC)的上调仅在用MMP9抑制剂处理的类器官中发现 (图7E)。
⑤进一步测试siRNA试验在hANO模型中的应用，发现与阴性对照siRNA相比，用siRNA-MMP9处理的类器官中凝胶降解延迟，纤毛细胞比例减少(补充图9)。
上述结果表明正常的粘膜纤毛分化，特别是hANOs的纤毛可能依赖于特定类型的MMP，例如MMP9、MMP7和MMP10。
Fig. 7 Characterization of hANOs treated with MM9 or MMP13 specific inhibitor, and neutralizing antibody of MMP7 or MMP10.
Supplementary Figure 9 Characterization of hANOs treated with MMP9 siRNA.
结论：
本文成功建立了人顶端外翻型鼻类器官模型，基于此模型，揭示了上皮来源的基质金属蛋白酶的表达和活性在类器官分化期具有关键作用，主要是通过降解细胞外基质介导了鼻上皮细胞的正常分化，抑制基质金属蛋白酶则显著抑制正常纤毛活动，导致杯状细胞比例增加。该类器官模型预期将在人呼吸道上皮生理和病理学研究提供有力的体外细胞平台。
汇报人： 周菁
导师：刘世喜
审核：任建君、庞文都
