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华西医院耳鼻咽喉头颈外科

精读分享│【Nature communications】：CD301b+树突状细胞来源的IL-2决定CD4+T辅助细胞分化

英文题目：CD301b+ dendritic cell-derived IL-2 dictates CD4+ T helper cell differentiation

中文题目：CD301b+树突状细胞来源的IL-2决定CD4+T辅助细胞分化

期刊：Nature Communications (IF=14.7)

单位：美国新泽西州纽瓦克市罗格斯新泽西医学院病理学、免疫学与检验医学系

发表时间：2025年2月

背景

树突状细胞（DC）在抗原特异性CD4⁺ T细胞的激活中发挥着重要作用，通过MHCII将抗原呈递给TCR，提供共刺激信号，还通过分泌细胞因子影响Th细胞的命运决定。各DC亚群在受到刺激时会产生特异性的细胞因子，从而倾向性地诱导不同类型的Th细胞。例如，在小鼠皮肤中cDC1通过产生IL-12优先诱导Th1细胞分化；朗格汉斯细胞通过产生IL-6来诱导Th17细胞的分化；而cDC2被证明对Th2细胞的分化是必需的。前期研究发现，CD301b⁺DC是cDC2的一个主要的、迁移型亚群，决定了CD4⁺ T细胞向Th2分化的命运。但CD301b⁺ DC是通过特异性识别决定Th2细胞命运，还是通过非抗原依赖性信号（如细胞因子）起作用，目前尚不清楚。

结果

CD301b⁺DC的直接抗原呈递是Th2细胞分化所必需的

将标记CFSE的OVA特异性TCR转基因CD4⁺ T细胞（OT-II细胞）输入CD301b⁺DC中特异性确缺失MHCII的转基因小鼠（CD301bΔMHCII小鼠）体内，并在其皮下免疫接种OVA和木瓜蛋白酶、氢氧化铝或CpG寡脱氧核苷酸（图a），研究OT-II细胞的分化。

在免疫接种7天后，CD301bΔMHCII小鼠淋巴结（LN）中的OT-II细胞表现出正常的细胞分裂，并且细胞数目略有增加（图b, c），提示OT-II细胞是由除CD301b⁺DC以外的其他抗原呈递细胞所激活的。然而，CD301bΔMHCII小鼠中的OT-II细胞未能分化为产生IL-4的Th2细胞，而其Th1细胞分化则未受影响（图d,e）。

同样地，当用OVA和氢氧化铝（诱导Th2免疫）免疫小鼠时，CD301bΔMHCII小鼠中OT-II细胞的Th2分化受到抑制，但其细胞分裂、数量或Th1细胞的分化均未受到影响（图f–h）。当用OVA加CpG寡脱氧核苷酸（诱导Th1免疫）免疫小鼠时，CD301bΔMHCII小鼠中OT-II细胞的增殖和Th1分化均未受到影响（图i-k）。

在皮下注射Nb寄生虫（该模型中寄生虫会在一天内迅速从皮肤迁移至肺）后，CD301bΔMHCII小鼠的皮肤和肺引流淋巴结中虽有相似数量的CD44⁺活化CD4⁺ T细胞，但这些活化T细胞产生IL-4的能力受损，说明寄生虫诱导的Th2分化需要与CD301b⁺DC相互作用（图l–n）。

CD301b+DC对于诱导CD4+T细胞充分表达CD25是必需的

用OVA和不同佐剂免疫DT处理的野生型（WT，CD301b+DC完整）或Mgl2-DTR（CD301b+DC去除）小鼠，24小时后将CFSE标记的OT-II细胞输入小鼠体内，2小时后通过抗-CD62L单抗阻止T细胞进一步进入淋巴结（图a）。

CD301b+DC去除的小鼠中OT-II细胞的CD69表达出现延迟，但很快得到恢复，可能是由于CD301b-DC的抗原呈递（图b）。而在CD301b+DC去除的小鼠中，CD25表达无延迟，但表达水平显著较低（图b,c）。CD301b+DC在上调CD25中的作用是亚群特异性的，因为在CD207-DTR小鼠中去除CD207+DC，包括朗格汉斯细胞和皮肤CD103+cDC1（图d），均未影响CD25的表达。

CD25（IL-2Rα）是IL-2受体复合体的高亲和力亚单位, pSTAT5是IL-2受体的主要信号传导成分。通过细胞内染色法检测表达Nur77-GFP报告基因的OT-II细胞中pSTAT5。结果显示，在CD301b+DC去除的小鼠中，OT-II细胞中pSTAT5的水平降低（图e, f）。相较之下，Nur77-GFP报告基因在刚进入LN时表达水平也低于WT小鼠（图e，0小时），但在稍后的时间点，两种小鼠的表达水平相似。这表明无论CD301b+DC是否去除，OT-II细胞接受的TCR刺激量相似（图e，16小时）。

在CD301b∆MHCII小鼠中，pSTAT5水平也降低（图f），表明CD301b+DC对OT-II细胞的抗原呈递作用对STAT5的激活是必需的。此外，当小鼠接受FCA（刺激Th1免疫）免疫时，CD301b+DC在OT-II细胞充分表达CD25和STAT5磷酸化的作用是亚群特异性的（图g–i）。

在用木瓜蛋白酶免疫的WT小鼠LN中，部分Nur77-GFP+OT-II细胞表达GATA-3，其水平与pSTAT5水平呈正相关（图j）。CD301b+DC去除导致OT-II细胞中GATA-3表达减少，这与STAT5激活受损相关（图j, k）。这些数据表明，CD301b+DC提供了一种独特的信号，这是抗原特异性CD4+T细胞充分表达CD25和Th2分化所必需的。

相较于Th1细胞，Th2细胞分化更依赖于IL-2R信号

上述数据表明Th2细胞分化需要充分的CD25表达，为进一步阐明IL-2R信号在体内的作用，接下来将等量的Il2ra+/+和Il2ra+/−或Il2ra−/− OT-II细胞混合，转移到接种了OVA加木瓜蛋白酶、FCA或CpG的小鼠中，比较CD25（IL2Rα）表达水平对细胞分化的影响（图a, d）。

IL-2产生和STAT5磷酸化水平呈现Il2ra基因表达依赖性变化（图b, c）。在木瓜蛋白酶和FCA免疫的小鼠中，Il2ra+/− OT-II细胞的扩增与Il2ra+/+ OT-II细胞相当；而在CpG免疫的小鼠中，Il2ra+/− OT-II细胞的扩增较低。而在所有佐剂免疫的小鼠中，Il2ra−/− OT-II细胞的扩增均显著低于Il2ra+/+ OT-II细胞（图e–g）。相同小鼠体内不同基因型的OT-II细胞存活率无明显差异（图h），提示扩增水平的差异可能由naïve OT-II招募受损引起。

Il2ra基因单拷贝缺失即可显著减少IL-4的产生，而对IFN-γ的影响则较小（图i）。借助同一宿主体内的Il2ra+/+ OT-II细胞进行标准化时，无论在木瓜蛋白酶还是FCA免疫的小鼠中，Il2ra+/− OT-II细胞的Th2分化程度均降低（图j）；而木瓜蛋白酶、FCA和CpG免疫的小鼠中Il2ra+/− OT-II细胞的Th1分化程度没有显著差异（图j）。此外，在不同模型中，Il2ra−/− OT-II细胞的Th1和Th2分化均显著受损（图j）。这些数据表明，尽管不同佐剂诱导的Th1/Th2分化程度存在显著差异，但CD25缺失对CD4+T细胞分化的影响相似。最重要的是，在各种模型中，CD25缺失对Th2分化的影响始终大于对Th1分化的影响。综上所述，相较于Th1细胞分化，抗原特异性CD4+ T细胞在体内的Th2命运更依赖于强效的自身IL-2R信号。

CD301b+DC来源的IL-2对于抗原特异性CD4+ T细胞的CD25充分上调和Th2细胞分化是必需的

CD25在抗原特异性CD4+ T细胞中通过两个连续步骤被诱导：首先是由TCR信号引起的初步上调，其次是IL-2驱动和CD25依赖的正反馈进一步促进Il2ra转录。激活的CD4+ T细胞通常被认为是这一反馈环路中IL-2的关键来源，但DC在激活后也能产生IL-2，尽管其在体内T细胞激活中的作用仍不明确。在免疫接种OVA和木瓜蛋白酶并转移OT-II细胞的小鼠中（图a），发现CD301b+DC在引流淋巴结（dLN）中表达的IL-2水平显著高于非引流淋巴结(ndLN)中的CD301b+DC，而在其他DC亚群中未观察到这种规律（图b）。

为了检验CD301b+DC来源的IL-2是否在抗原特异性CD4+ T细胞的激活和分化中的作用，构建了CD301b+DC特异性缺失IL-2的小鼠（CD301bΔIL-2小鼠），并在免疫接种OVA和木瓜蛋白酶后检测OT-II细胞的激活和分化（图 c-k）。值得注意的是，在WT小鼠中阻断IL-2导致OT-II细胞中的CD25表达减少。同样，在CD301bΔIL-2小鼠中，尽管几乎所有OT-II细胞都表达了CD69，但OT-II细胞未能完全上调CD25（图d-f），表明CD301b+DC来源的IL-2对于抗原特异性CD4+ T细胞完全表达CD25是必要条件。此外，使用4get;OT-II报告基因的小鼠监测Th2细胞分化时，发现CD301bΔIL-2小鼠体内的Th2细胞分化被完全抑制，但细胞周期进程、扩增或Th1分化未受影响（图g-k）。这些结果表明，CD301b+DC来源的IL-2对于诱导抗原特异性CD4+ T细胞的CD25充分上调和Th2命运至关重要。

CD301b+DC来源的CD25是Th2细胞分化所必需的

CD301b+DC中CD25的表达高于CD301b−DC（图l），但几乎不表达CD122（IL-2Rβ），这表明CD301b+DC中的IL-2受体无法有效信号传导，因为CD122是信号传导所必需的。在体外用IL-2刺激初级WT小鼠中提取的淋巴结细胞，pSTAT5仅在CD4+ T细胞中被检测到，而DC中未检出（数据未显示），进一步表明CD301b+DC中的CD25并未促进IL-2的信号传导。

在CD301b+DC特异性缺失CD25的小鼠（CD301bΔCD25小鼠）中，OT-II细胞的Th2分化显著受阻，但未影响其扩增、Th1分化或每个DC亚群的数量（图m-q）。CD301b+DC中缺失CD25导致OT-II细胞中pSTAT5的减少，但未影响内源性Treg（图r-t），表明CD301b+DC中CD25表达有助于IL-2定向作用于配对的CD4+ T细胞。这些结果表明，CD301b+DC通过表达CD25从而增强IL-2对配对CD4+ T细胞的可用性，继而促进Th2细胞分化。

CD40刺激诱导CD301b+DC产生IL2

用OVA和木瓜蛋白酶免疫小鼠，一天后从对照小鼠或免疫小鼠皮肤dLN中分离出MHCIIhi迁移性DC，采用CITEseq技术同时分析mRNA和细胞表面标记物的表达。细胞表面标记物的无监督聚类分析将DC分为3个主要的DC亚群，7个不同的簇（图a）。cDC2被进一步细分为3个亚群，分别是CD301blo、CD301bint和CD301bhiDC（图b）。另外，根据mRNA表达谱，cDC2被进一步分为5个亚簇，其中亚簇2和5主要由对照小鼠cDC2组成，而亚簇1、3和4则主要来源于免疫小鼠中的cDC2（图a, c）。cDC2亚簇1、2和3中的细胞更多富集于CD301bint和CD301bhiDC，而亚簇4和5中的细胞则更富集于CD301bloDC（图b, c）。Il2 mRNA在所有DC亚群中均有表达，包括CD301bhiDC（图d）。

在免疫小鼠中，与所有其他DC亚群相比，CD301bhiDC表达差异基因的通路分析（Ingenuity Pathway Analysis）发现多个通路，其中CD40通路在对照小鼠和免疫小鼠中富集（图e, f）。在免疫小鼠的dLN和ndLN中，CD301b+DC中CD40表达水平高于CD301b−DC（图g, h）。

通过腹腔注射激动性抗CD40抗体（FGK4.5）激活CD40，可以诱导CD301b+DC产生IL-2，并上调CD80、CD86和CD25（图i, j）。值得注意的是，CD40诱导的IL-2产生仅特异性地出现在CD301b+DC中（图i）。这些数据表明，CD40激活能够刺激CD301b+DC产生IL-2并上调共刺激分子。

CD301b+ DC内源性CD40是Th2细胞分化所必需的

先前研究表明，CD40在Th2细胞分化中的必要性，但其潜在机制尚不明确。相比于WT小鼠，CD40缺失的小鼠中，用OVA加papain激活的OT-II细胞，报告Il4的GFP表达显著降低，但它们的扩增、细胞分裂以及Th1分化仍然相似（数据未显示）。构建混合骨髓嵌合（BMC）小鼠模型，其体内MHCII缺失的细胞不表达CD40，而表达CD40的细胞无法向CD4+ T细胞呈递抗原。当OT-II细胞在BMC小鼠体内活化时，其Th2分化也受损，但Th1分化未受影响（图a-c）。这些数据表明，CD40信号传导和抗原呈递必须同时在同一细胞中进行，才能特异性地指导Th2细胞分化。

接下来用1:1混合的CD40−/−和Mgl2-DTR骨髓细胞重建了致死性辐射的小鼠（图d）。在这些重建小鼠（CD301bΔCD40 BMC）中，CD301b+DC表现为CD40−/−，而所有CD301b−DC维持了1:1的嵌合性（图e）。尽管CD40−/− CD301b+DC中的MHCII表达与WT CD301b+DC相当（图f），但在CD301bΔCD40BMC小鼠中，用OVA和木瓜蛋白酶免疫后的OT-II细胞Th2细胞比例明显降低，然而Th1细胞并未变化（图g）。这些数据表明，CD301b+ DC内源性CD40对于Th2细胞命运决定是必需的。

CD301b+DC是Th2细胞分化的充分条件

迄今为止的数据表明，CD301b+DC通过直接的抗原呈递、CD40表达和IL-2产生共同作用，参与了Th2细胞的分化。为了验证CD301b+ DC是否足够且无需其他DC亚群的协助就能指示Th2细胞的命运，团队利用CD11c-dlDTR小鼠与Mgl2-Cre小鼠的交叉品系（Mgl2-Cre;CD11c-dlDTR小鼠）。在这些小鼠中，CD301b+DC保留，而CD301b−DC可被DT清除。OT-II细胞在Th2（papain）和非Th2（FCA）免疫条件下都能正常分化为Th1和Th2细胞（图h-j）。结果表明，在这些免疫条件下，CD301b+ DC对于Th2细胞的分化不仅是必要条件，也是充分条件。

CD301b+ DC通过内在CD40-IL-2轴决定CD4+T细胞的Th2分化

为了进一步阐明Th2分化是否充分依赖于CD301b+DC细胞内的CD40-IL-2通路，研究团队使用阻断性抗CD154（CD40L）单抗（MR-1）和激动性抗CD40（FGK4.5）单抗对小鼠模型进行干预。CD154阻断或CD40基因缺失（而非CD40激动）均导致OVA和木瓜蛋白酶免疫后OT-II细胞CD25上调受损，但不影响CD69的表达（图k-m）。

在WT小鼠中阻断CD154可使OT-II细胞的Th2分化受到抑制，而CD40的激动能够恢复Th2细胞分化，即使CD154信号被阻断，表明单纯的CD40激动足以驱动Th2分化（图n, o）。然而，当IL-2被中和时，CD40激动未能恢复Th2细胞分化，表明IL-2在CD40信号的下游参与Th2分化命运（图o）。此外，当在CD301b+DC缺陷小鼠、CD301bΔIL-2小鼠或CD301bΔMHCII小鼠中进行CD40激活时，均未能恢复OT-II细胞的Th2分化（图o）。各种模型之间也未观察到OT-II细胞增殖的显著差异（图p）。这些数据表明，CD301b+ DC与抗原特异性CD4+ T细胞之间的MHCII-TCR和CD40相互作用，以及由此引起的CD301b+DC IL-2的分泌，在Th2细胞分化中起着决定性作用。

总结

本研究发现CD301b⁺ DCs通过MHCII和CD40与CD4⁺ T细胞配对相互作用从而诱导Th2细胞分化。其中，CD40的激活特异性地诱导CD301b⁺ DCs产生IL-2，这一过程对于抗原特异性CD4⁺ T细胞中CD25的充分上调及其后续IL-2R信号传导至关重要。在抗原特异性CD4⁺ T细胞中，相较于Th1细胞分化，CD25的充分表达对其Th2细胞分化更重要。此外，初始激活后CD4⁺ T细胞中的IL-2R信号传导也需要CD301b⁺ DCs中表达CD25，这提示DC来源的CD25可能促进IL-2的定向作用。这些数据强调了DC内源性CD40–IL-2轴在Th细胞分化路径分岔中的关键作用。

研究思路

全文进行了大量体内实验，采用不同的体内抗体、基因编辑小鼠和细胞对所要研究的分子、细胞进行干预；并将CFSE标记的OVA特异性OT-II细胞输入不同小鼠体内，以OVA+不同佐剂免疫小鼠构建炎症模型，再用流式细胞术检测OT-II细胞活化、增殖、分化、信号转导情况。

汇报人：蒋子涵

导师：刘世喜

审核：杨柠菲、任建君