张子妍
华西耳鼻喉学术前沿速递——文献精读（第58期）
精读分享│【Nature】：使用ctDNA追踪TRACERx中的早期肺癌播散
英文题目：Tracking early lung cancer metastatic dissemination in TRACERx using ctDNA
中文题目：使用ctDNA追踪TRACERx中的早期肺癌播散
期刊：Nature（IF: 50.5）
单位：英国伦敦大学学院
发表时间：2023年4月
摘要：
循环肿瘤DNA（ctDNA）可用于检测和分析根治性治疗后残留的肿瘤细胞。为了明确ctDNA能否作为早期非小细胞肺癌（NSCLC）复发的生物标志物，研究需要结合大规模患者队列的纵向血浆采样和长期随访。本研究开发了ctDNA检测方法，该方法可在TRACERx研究中入组的197名NSCLC患者的1069份血浆样本中追踪从切除的肿瘤组织中鉴定出的大约200个突变。术前未检测到ctDNA可区分有良好临床预后的惰性肺腺癌。在标准护理的影像学监测和细胞毒性辅助治疗的背景下，解读了术后血浆分析结果。手术后120天内采集的血浆样本的标志性分析显示，25%的患者检测到ctDNA，其中包括49%临床复发的患者；每3至6个月的ctDNA监测又在标志性阴性的患者中识别出20%即将复发的病例。本团队开发了一种生物信息学工具（ECLIPSE），用于在低ctDNA水平下无创追踪亚克隆结构。ECLIPSE可识别出多克隆转移性播散的患者，此类患者的临床结局较差。通过测量术前血浆中的亚克隆癌细胞比例，本研究发现形成转移的亚克隆相较于非转移性亚克隆显著扩增。本研究结果将支持（新）辅助试验的进展，并为低ctDNA水平的液体活检研究转移播散过程提供见解。
思维导图：
研究背景：
循环肿瘤DNA（ctDNA）是一种特征性的肿瘤生物标志物，可用于检测和分析治疗后的肿瘤残留病灶。已有研究显示，术前/术后ctDNA水平可以反映早期非小细胞肺癌（NSCLC）的复发风险，也有助于指导辅助治疗。
在TRACERx项目研究中，接受切除手术的NSCLC患者在手术后随访5年，术前和术后前两年每3个月收集一次血浆，第3-5年每6个月收集一次血浆。已有研究数据证实，14例NSCLC复发患者中有13例术后可检测到ctDNA，为了解残留病灶的克隆结构提供了线索，并阐明了ctDNA作为早期NSCLC复发生物标志物的潜力。
本文讨论了术前ctDNA检测的预后影响，以及术后ctDNA检测对于疾病复发和转移的重要监测作用，并开发了一种生物信息学工具（ECLIPSE），结合锚定多重PCR技术（AMP）以及患者特异性富集组（PSPs），在具有0.1%肿瘤含量的血浆样品中，对于20%癌细胞组分（CCF）亚克隆能够实现约94%的检测灵敏度。
主要方法：
一、样本收集：
1.收集非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血浆样本。
二、cfDNA提取：
1.使用MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit和KingFisher™ Flex Purification System从血浆中提取cfDNA。
三、DNA定量：
1.使用Qubit 3.0 Fluorometer和Qubit dsDNA HS Assay Kit对提取的cfDNA进行定量。
四、Anchored-Multiplex PCR (AMP)：
1.利用AMP技术构建患者特异性的cfDNA富集文库（PSPs），这个技术可以针对预先在肿瘤组织中鉴定的特定突变进行富集。
2.患者特异性嵌合多重PCR（AMP）靶向肿瘤组织中预先鉴定的200个突变（包括克隆和亚克隆突变），以敏感地识别ctDNA。
五、测序：
1.使用NovaSeq 6000 System进行高通量测序，目标是每个文库测序约1000万读段。
六、数据分析：
1.使用MRD（分子残留病）检测算法评估背景测序噪声，并计算ctDNA的存在。
2.应用ECLIPSE工具，这是一个非侵入性跟踪低ctDNA水平下亚克隆结构的生物信息学工具。
七、MRD检测算法：
1.评估每个文库的背景测序噪声，以确定ctDNA的存在。
2.使用Poisson测试比较观察到的变异等位基因频率（VAFs）与预期的背景错误率。
八、ECLIPSE工具：
1.利用ECLIPSE工具评估低丰度ctDNA水平下的克隆组成，结合肿瘤组织衍生的拷贝数信息来估计特定肿瘤亚克隆的存在与否，并计算它们的癌症细胞分数（CCFs）。
九、克隆和亚克隆结构分析：
1.通过ECLIPSE工具，研究人员能够估计肿瘤亚克隆的组成，并分析其在复发时的克隆进化。
十、验证：
1.对于预操作ctDNA阳性样本，使用数字滴落PCR（ ddPCR）进行验证。
主要结果：
1.使用AMP检测ctDNA的技术以及术前ctDNA检测与临床结果的相关性
AMP患者特异性富集panel（PSP）针对早期NSCLC手术切除样本的多区域外显子组中预先确定的约200个突变追踪了其中126个克隆突变，以及64个亚克隆突变（占手术组织中取样亚克隆的88%），以推断肺癌复发时的亚克隆进化。
接下来，本研究探究了术前ctDNA状态（阴性/阳性，低/高）与临床结果的相关性。在腺癌患者中，ctDNA状态与总生存期 (OS) 相关。术前ctDNA阴性的52例腺癌患者的OS显著优于ctDNA低或ctDNA高的患者。在非腺癌患者中，81例中7例ctDNA阴性患者的OS与ctDNA低或高的患者无显著差异，且ctDNA状态并未表现出显著的预后价值。这支持了此前的研究发现，即术前ctDNA状态是腺癌中无复发生存（RFS）的稳健预后因素，但对鳞状细胞癌无显著意义。
2.ctDNA检测的生物学特征
本研究对150例 NSCLC 患者的计算机断层扫描（CT）体积数据进行分析，发现10cm3肿瘤体积与约0.1%的ctDNA水平相关。42例肿瘤体积大于10cm3的肺腺癌患者中有17例术前ctDNA（-），而50例非肺腺癌患者中只有2例术前ctDNA（-）——在肿瘤体积较大的肺腺癌中，ctDNA检测的相对缺失提示了低ctDNA脱落表型。然后，研究人员估计了47例 ctDNA（-）肺腺癌的克隆ctDNA水平，并将这些肿瘤分类为低脱落组（根据肿瘤体积预计进行 ctDNA 检测，但未检测到）和技术阴性组（根据肿瘤体积预测的 ctDNA 水平低于样本检测限度/阈值），后者被排除在ctDNA检测和肿瘤生物学分析之外。
接着，基于可用的多区域转录组学数据，研究者将34例ctDNA（+）肺腺癌与28例低脱落肺腺癌进行了差异分析。在ctDNA（+）肺腺癌中上调的基因包括与细胞分裂周期和DNA修复相关的基因，基因集变异分析（GSVA）同样显示增殖和细胞周期相关基因上调。评估已发表的肺腺癌预后相关生物标志物（ORACLE）发现，术前ctDNA（+）肺腺癌的ORACLE评分显著高于ctDNA（-）肺腺癌。此外，ctDNA（+）腺癌的加权基因组完整性指数（wGII）和杂合性损失分数（FLOH）的水平均高于低脱落组。
3.术后ctDNA检测与复发的相关性
接下来，该团队分析了70例NSCLC复发（n = 66）和不完全切除患者（n=4）的术后ctDNA。70例患者中有59例（84%）术后（复发前或复发后）检测到ctDNA。
研究者在Landmark检测框架（在手术完成后120天内检测并记录患者的ctDNA状态）内分析了术后ctDNA检测。131例术后血浆取样患者中有108例在辅助治疗或复发前120天内获得≥1份血浆样本可用于Landmark分析。
分析结果表明，在landmark时，108例患者中有27例（25%）表现出1个或多个ctDNA（+）信号，27例患者中有25例复发（landmark的阳性预测值为93%，阴性预测值为68%，敏感性为49%）。landmark阳性状态与pTNM分期具有较高的相关性。
4. 影像学与ctDNA
接着，研究者进一步评估了术后ctDNA检测对于颅外CT、磁共振成像和正电子发射断层扫描成像的术后辅助治疗效果。结果发现在监测成像显示新发可疑淋巴结病之前，14例患者ctDNA（+），20例患者ctDNA（-）。14名ctDNA（+）患者中共有11名（79%）随后复发，这表明ctDNA检测结果可以帮助确认可疑放射部位的治疗干预方案。
5. 亚克隆检测预测转移
为了从血浆cfDNA的深度靶向测序得到肿瘤亚克隆组成，本研究开发了 ECLIPSE，其可以利用背景噪声估计和肿瘤组织的拷贝数信息来评估特定肿瘤亚克隆的存在，并从cfDNA数据计算癌细胞组分（CCF）。研究者预估，0.1%克隆 ctDNA血浆中20% CCF亚克隆的检测灵敏度为94%。研究者对26名患者的高亚克隆敏感性术后血浆样本和复发组织样本进行分析，发现复发组织中检测到的亚克隆与术后ctDNA之间具有高度一致性。在手术时预测随后转移复发的亚克隆组成，可为针对亚克隆驱动疾病复发的精准辅助治疗提供依据。
对于术后未检测到原发性肿瘤亚克隆的情况，术前血浆样本中检测到的cfDNA能显示出更大的CCF，且这些转移性亚克隆在复发时倾向于进一步扩增，这些结果表明可以利用ctDNA检测原发性NSCLC亚克隆以预测转移扩散。
6. 克隆进化的纵向追踪
亚克隆CCF计算联合ctDNA靶向检测结果，有助于利用ctDNA推断原发肿瘤到复发的扩散模式。本研究对44例NSCLC患者进行了从手术到复发的纵向血浆和组织克隆组成分析。结果显示，与复发活检组织相比，使用ctDNA检测时复发时多克隆转移扩散的频率增加——这是由ctDNA特有亚克隆所驱动的。总体而言，44例复发肿瘤中有32例被定义为单克隆扩散，12例被定义为多克隆扩散，多克隆扩散患者比单克隆扩散患者的生存期更短。
接下来，研究者详细介绍了2例患者的情况。
图C：研究者观察患者CRUK0484在治疗时的克隆组成变化，其在手术后的辅助化疗期间，超过一半的肿瘤细胞中存在亚克隆的消除（克隆 a），在复发后的免疫疗法治疗期间，次要亚克隆谱系有明显的扩增（克隆 b）并超过平行谱系（克隆 c）。研究者在不同的时间点和转移部位进行了三次复发组织活检，显性克隆c仅在手术切除的淋巴结中检测到。
图D：而CRUK0050患者：在血浆中观察到的克隆变异等位基因频率（VAF）的多模态分布表明：与手术采集的样本相比，复发后的细胞毒性化疗期间，观察到克隆ctDNA 水平的快速增加，130个克隆突变中的59个改变了它们的拷贝数状态，包括致癌KRAS G12R的突变扩增。这意味着在治疗期间新亚克隆的扩增具有显著的染色体不稳定性。
讨论
相比于组织活检或者手术中提取组织样本，ctDNA分析是一种非侵入性的方式让研究者们更全面地了解肿瘤在患者疾病过程中的变化。
本研究开发了ctDNA的检测方法，通过收集从TRACERx研究中招募的 197名患者的1,069份血浆样本，追踪了从肿瘤组织中预先确定的200个突变，证实术前ctDNA检测是早期肺腺癌的重要预后指标，并且染色体不稳定性是该NSCLC亚型ctDNA检测的预测因子。
本研究还开发了一种生物信息学工具（ECLIPSE），用于在低ctDNA水平下非侵入性追踪亚克隆结构，并提出在手术前测量血浆中的亚克隆扩增可以有助于预测未来的转移性亚克隆，提供早期干预的可能性，并进一步提出生物标志物开发的新途径，为肺癌早筛和辅助性诊疗技术的发展奠定了基础。
汇报人：张子妍
导师：赵宇
审核：宋瑶、任建君
