原创 张玉忠 华西医院耳鼻喉科

摘要：

视网膜的解剖结构在脊椎动物中基本一致，但各个物种在视觉需求上存在显著差异。视网膜细胞类型可能已经演化以适应这些不同的需求，但尚未进行系统地研究。本文作者生成并整合了来自17个物种的视网膜单细胞转录组图谱：包括人类、两种非人灵长类动物、四种啮齿动物、三种有蹄类动物、负鼠、雪貂、树鼩、鸟类、爬行动物、硬骨鱼以及七鳃鳗。研究人员发现了六种视网膜细胞类型（感光细胞、水平细胞、双极细胞、星形胶质细胞、视网膜神经节细胞（RGCs）以及Müller胶质细胞）的高度保守性，且跨物种的转录组变化与演化距离相关。细胞类型的主要的亚类也是保守的，而类或亚类内部细胞类型的变化则比较显著。然而，整合分析揭示了基于可能追溯到早期祖先脊椎动物的保守基因表达程序，许多细胞类型在不同物种之间是共享的。从外视网膜（感光细胞）到内视网膜（RGCs）细胞类型之间的差异程度逐渐增加，这表明演化优先塑造视网膜输出。最后，研究人员确定了啮齿类动物midget RGC的直系同源物，其在人类视网膜中占RGC的80%以上，有助于提高视觉灵敏度，以前被认为仅限于灵长类动物。相比之下，小鼠同源物具有较大的感受野，约占小鼠RGC的2%。灵长类动物和小鼠同源类型的投射在丘脑中都有较高的代表性，而丘脑是初级视觉皮层的供应来源。总之，研究人员认为，midget RGC不是灵长类动物创新的细胞类型，而是从古老类型演化而来的，随着灵长类动物演化，midget RGC的体积减少、数量增加，从而有助于提高视敏度和增加皮层对视觉信息的处理。

视网膜的基本结构在脊椎动物中高度保守。视网膜包含五种神经元细胞类型：感光细胞（PR）、水平细胞（HC）、双极细胞（BC）、星形细胞（AC）和视网膜神经节细胞（RGCs）以及Müller神经胶质细胞（MG）（图2）。外核层中感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）感知光并将视觉诱发的信号传输给内核层的间接神经元；间接神经元（水平细胞、双极细胞和星形细胞）处理信息并将其提供给内层的RGCs；RGCs通过视神经将信息发送到大脑中的视觉中枢。几种神经元细胞类别可以细分为亚类，所有类别都包括在形态学、生理学以及分子成分上的多种类型。间接神经元和RGCs类型之间的连接特异性赋予了许多RGCs类型对视觉特征的选择性反应，例如视野、方向运动和色度。

作者分析了在小鼠和灵长类动物中已经验证的marker基因的表达；许多基因在其他脊椎动物中显示出相似的表达模式（图3a）。利用marker基因，将每个物种内的细胞分为六类。然后，通过比较基于共享同源基因的“pseudobulk”转录组文件来评估细胞类型之间的物种间相似性。16种有颌脊椎动物之间的交叉相关分析表明，转录组的相似性是由细胞类型而不是物种身份驱动的—例如，某物种的双极细胞与其他物种的双极细胞之间的关系比它们与同一物种的其他类别之间的关系更密切（图3b、c）。研究发现，细胞类内的保守基因包括许多编码已知祖代决定转录因子的基因，例如POU4F1（RGCs）、VSX2（BC和MG）、OTX2（PR和BC）、TFAP2A-C（AC）、ONECUT1/2（HC）和CRX（PR）（图3a）。这表明，神经发生和细胞类型命运的决定是演化自古老的遗传机制。

此外，通过比较pseudobulk文件中平均平方表达式分散度和每个细胞类型之间的进化距离来评估进化趋势。根据幂律，表达分散度随着进化距离的增加而增加，这一趋势在所有细胞类型中相似（图3e）。虽然pseudobulk水平的变异可能来自于细胞类型组成的变化以及单个细胞类型中基因表达的变化，但MC的方差与更复杂的细胞类别的方差相似，这表明pseudobulk水平的变异主要由单个细胞类型中的基因表达变化所主导。因此，稳定性和/或同源型可能有助于视网膜细胞类别特异性转录组的演化。

图 4双极细胞的多物种整合

作者通过分析哺乳动物双极细胞（BC）类型之间的演化变异来说明神经元细胞亚类型的保守型。在小鼠中有15种BC类型：6种OFF型和9种ON型BC；ON型BC中的一种主要从视杆细胞接收输入，而其他所有类型主要从视锥细胞接收输入。首先对哺乳动物HC聚类生成由物种定义的可视化分布图（图4a）。这些数据集被重新分析，使用了一种整合方法来减少物种特异信号，从而强调了转录组关系。这种分析使得不同物种之间的BC细胞混合在一起，同时保留了将ON视锥细胞、OFF视锥细胞和ON 视杆细胞相互区分的可视化结构（图4b）。整合后的数据显示出了基于共享的转录组特征的14个细胞群（图4c）。小鼠双极细胞类型与整合群以1:1的方式映射，唯一的例外是BC8和BC9映射到同一群（图3d）。这些群体为神经元同源型，根据小鼠的细胞类型命名了BC的同源型；每种BC同源型几乎在所有哺乳动物中都有代表，并且91%的哺乳动物BC的聚类（共190个）主要映射到单个同源型（图4d）。此外，作者确定了能够区分BC同源型的不同表达基因（图4e）。当哺乳动物、小鸡、蜥蜴和斑马鱼的BC一起整合时，“哺乳动物”同源型仍然稳健。尽管用于指导分析的同源基因减少了32%，但小鸡、蜥蜴和少数斑马鱼的BC群部分也可以映射到这些哺乳动物同源型（图4d，右侧）。为了说明整合的效用，作者重点介绍两种BC同源型：oRBC和oBC1B（图4f）。RBCs主要从视锥细胞接收输入，它们与特定的星形细胞类型相连接，而不是直接与RGCs连接。oRBC包含了所有哺乳动物的RBCs（图4f）。哺乳动物RBCs以高表达PRKCA和LRRTM4（图4e）区分，这两者在小鼠中是RBC特异性的。RBCs也表现出物种特异的基因表达。在小鸡和斑马鱼中已经描述了RBCs，但这些类型并未映射到oRBC。第二个同源型代表了小鼠中描述的一个非经典OFF型BC，称为BC1B或GluMI33。BC1B的名称反映了它与BC1A的转录相似性。然而，与经典BC不同，BC1B在早期出生后期会收缩其树突，因此与成熟的感光细胞没有直接连接，其他物种中尚未发现BC1B的同源型。然而，在10种哺乳动物中，以及小鸡和蜥蜴，包含了一个仅映射到oBC1B的BC聚类（图4f），而两种哺乳动物（Peromyscus和雪貂）则包含了同时映射到oBC1A和oBC1B的聚类。以上结果表明：转录组学能够识别出通过传统形态学方法难以识别的潜在保守的细胞类型。作者对感光细胞和HC进行了同样的同源型分析。感光细胞被分为两个亚类：视杆细胞和视锥细胞。大多数哺乳动物只有一个视杆细胞类型和两个视锥细胞类型。然而，许多灵长类动物具有对长波长敏感的第三种锥状细胞类型（L锥状细胞）。同源型分析能够有效地区分哺乳动物的视锥细胞的亚型（图4g）。同样，大多数哺乳动物具有两种HC类型，称为H1和H2。同源型分析将HC分为两组（图4h）。

接下来，作者对视网膜中唯一的输出神经元——RGCs进行了同源型分析。在哺乳动物中确定了21种RGC同源型，并确定了能够区分它们的差异表达基因（图5a–c）。81%的哺乳动物RGC聚类（408中的329个）主要映射到一个单一的同源型（图5d）。在包含比同源型更多的RGC类型的物种中，转录组相似的RGC聚类映射到同一个同源型。与BC一样，当蜥蜴、小鸡和斑马鱼被纳入整合时，RGC同源型保持稳定（图5d，右侧）。为了测试RGC同源型分析的可靠性，作者搜索了一组具有进化古老特征的RGC类型的同源基因，称为固有感光RGCs（ipRGCs）。ipRGCs包含光感受体黑素蛋白（由OPN4编码），使它们能够在没有光感受器输入的情况下产生视觉引发的信号。它们介导关键的非成像视觉功能，例如昼夜节律同步和瞳孔光反射。在已知的多个脊椎动物目的视网膜中发现了ipRGCs，包括这里分析的几种物种，通常是基于OPN4的表达。ipRGCs也表达了转录因子编码基因EOMES（也称为TBR2），尽管一些表达EOMES的RGCs尚未被功能验证为ipRGCs。在两个同源型oRGC8和oRGC9中，表达了OPN4的RGCs。oRGC9包含五种小鼠RGC类型，其中三种是ipRGC类型M1a、M1b和M2，它们表达着最高水平的黑素蛋白。oRGC8包含了同源类型MX和C8。总体而言，在这两个oRGC中的11个物种的35个聚类中，有25个表达了OPN4，33个表达了EOMES。小鸡和蜥蜴中的表达OPN4的RGC类型也映射到了这些同源型上。因此，跨物种整合捕捉到了具有保守生理特性的一个RGC群体。这些结果表明，正如上面对感光细胞、BC和AC亚类的研究类似，可能可以将RGCs分类为具有保守的亚类。尽管所有神经元类的同源型在所有哺乳动物中都有相应的类型，但物种内的神经元类型数量的变化范围比其他类更大。因此，从外到内视网膜的神经元细胞类型中的变化程度按照感光细胞<星形细胞<双极细胞<rgc的顺序逐渐增加。< p=""></rgc的顺序逐渐增加。<>

对大多数物种的研究表明，基本没有物种RGC亚细胞类型超过所有RGC的10%。但人类的ON和OFF的midget RGC占所有RGC的80%以上，且在视网膜中央凹和周围具有相似的丰度。然而，尽管它们对视觉至关重要，但midget RGC在非灵长类物种的同源物尚未被发现。类似地，另外一种灵长类的RGC类型，即ON和OFF的parasol RGC（占所有RGC的5-10%），在非灵长类物种也未发现的同源型。研究者使用转录组同源型重新进行了分析。四种丰富的灵长类RGC类型中的每一种映射到一个独特的同源型（oRGC1、oRGC2、oRGC4和oRGC5），每个同源型都包含来自人类、猴子和无尾狨的中央凹和外周相应细胞类型（图6a）。值得注意的是，映射到这些同源型的小鼠RGC类型包括一个称为α-RGCs的四组相关类型；在映射到ON和OFF的midget和OFF的parasol细胞的同源型中，五个小鼠细胞类型中有三个是α-RGCs。先前已经提出了parasol RGC与α-RGCs的相似性，但midget RGC与α-RGCs的对应关系是新发现的，因为α-RGCs的丰度很低（约为2%）且是小鼠视网膜RGCs数量最多的类型之一。通过综合分析α-RGCs的极性、响应动力学、树突分枝和信息输入方式等结果，强有力地支持了灵长类midget和parasol RGC与小鼠α-RGC的同源性（图6 b, c, d, e）。表明midget和parasol RGC并不是像人们过去认为的那样是灵长类的创新的细胞类型，而是从古老类型演化而来的，随着灵长类动物演化，midget RGC的体积减少、数量增加，从而有助于提高视敏度和增加皮层对视觉信息的处理。

主要结论：

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-06638-9

汇报人： 张玉忠

导师：赵宇  程静

编辑：陈秋蓉

审核：任建君  夏晓旭