精读分享│【Advance Science】：Conditional Overexpression of Serpine2 Promotes Hair Cell Regeneration from Lgr5+ Progenitors in the Neonatal Mouse Cochlea

英文题目：Conditional Overexpression of Serpine2 Promotes Hair Cell Regeneration from Lgr5+ Progenitors in the Neonatal Mouse Cochlea

中文题目：Serpine2 的条件性过表达促进新生小鼠耳蜗 Lgr5 + 祖细胞的毛细胞再生

期    刊：Advanced Science (IF=14.1)

单    位：东南大学柴人杰团队

时    间：2025年3月17日

摘要

研究背景：

新生儿耳蜗Lgr5+祖细胞保留有限的毛细胞（HC）再生能力，但其调控网络尚未完全阐明。前期体外研究表明，丝氨酸蛋白酶抑制剂E成员2（Serpine2）参与调控耳蜗Lgr5+祖细胞的增殖与分化，但其在体内的表达模式及功能尚不明确。

研究发现：

表达模式：Serpine2在小鼠出生后耳蜗中呈年龄相关性下降表达；

功能验证：在新生儿耳蜗Lgr5+祖细胞中条件性过表达Serpine2，观察到剂量依赖性的异位毛细胞数量增加；体外和体内Serpine2敲除实验能抑制毛细胞再生；

机制探究：EdU检测和谱系追踪实验证实这些异位毛细胞更可能源自Lgr5+祖细胞的直接转分化而非有丝分裂再生；单核RNA测序分析和mRNA水平验证表明，条件性过表达的Serpine2可能通过抑制音猬因子（SHH）信号通路、激活Atoh1和Pou4f3转录因子来诱导毛细胞再生。

结论：

该研究揭示了Serpine2在新生儿耳蜗Lgr5+祖细胞毛细胞再生中的关键作用，为毛细胞再生研究提供了新思路。

引言

感音神经性耳聋（SNHL）主要致病机制是耳蜗毛细胞（HCs）的缺失或损伤。成年哺乳动物毛细胞损伤不可逆，但鱼类和鸟类支持细胞（SCs）具有再生为毛细胞的能力。已有研究表明，新生小鼠内耳具有短暂的毛细胞再生能力，但该能力在出生后迅速丧失。因此，阐明毛细胞再生的分子机制以开发SNHL治疗策略具有迫切需求。

Lgr5作为Wnt通路靶基因，标记多种组织（如耳蜗）中的祖细胞。小鼠耳蜗内指细胞、第三排Deiters细胞、内柱细胞及部分大上皮嵴细胞等特定支持细胞亚群表达Lgr5，具有内耳祖细胞特性。耳蜗支持细胞或祖细胞可能通过Atoh1、Gfi1、Pou4f3、Foxg1等转录因子及Wnt、Notch、Hippo等信号通路调控毛细胞再生。但成年哺乳动物毛细胞再生效率仍有限，需探索新的调控因子。

前期研究通过分析不同再生条件下Lgr5+祖细胞的转录组，筛选出多个潜在参与毛细胞再生的新基因，其中丝氨酸蛋白酶抑制剂E成员2（Serpine2）在体外实验中显示出调控毛细胞再生的潜力。但其是否在体内调控耳蜗Lgr5+祖细胞增殖分化从而影响毛细胞再生尚不清楚。

研究思路

模型构建

CreERT系统

Cre重组酶（cyclization recombinase）可识别一段名为Loxp的特定基因序列：Loxp序列长34个碱基，包括中间8碱基的不对称序列，以及两侧反向回文的13碱基序列。中间的8碱基决定了Loxp序列的方向，而Loxp序列的方向决定了Cre酶的剪切方式。通常，Loxp序列会成对出现。如果两个Loxp的方向相同，当Cre酶结合两个Loxp位点后，会删除两个Loxp之间的基因序列，以及一个Loxp序列；如果两个Loxp序列方向相反，Cre重组酶则会将两个Loxp之间的基因序列反转、左右颠倒，这种重组反应处于动态平衡中。

雌激素受体（ER）：在没有雌激素的情况下，核雌激素受体跟热休克蛋白90（HSP90）结合在一起，无法进入细胞核，只能游荡于细胞质内。雌激素出现后，雌激素会跟核雌激素受体结合，并将热休克蛋白90从雌激素受体上排挤走，雌激素受体便可进入细胞核，调控位于核内的基因的表达。

将雌激素受体的配体结合域和Cre酶融合在一起，并突变雌激素受体，使其不再结合体内雌激素，只对他莫昔芬（Tamoxifen）这种外源药物有亲和力——只有当他莫昔芬出现时，Cre酶才能入核调控基因表达。同时，由于与Cre酶融合的只是雌激素受体的配体结合域，因此不会触发雌激素受体相应的基因调控。

通过CRISPR/Cas9技术在Hipp11（H11）位点插入包含Serpine2基因序列和3×HA标签的载体，构建Serpine2loxp/+转基因小鼠（图1D），并鉴定基因型（图1E），P1阶段通过腹腔注射他莫昔芬诱导Cre 酶切除loxP位点间STOP 终止子，实现Serpine2 cOE组小鼠基底膜（BM）的Serpine2过表达（图1F）。

杂合型Serpine2过表达：仅一个等位基因被loxP序列修饰，另一个等位基因保持野生型（未编辑）（图A）。

纯和型Serpine2过表达：两个等位基因都被loxP序列修饰（条件性可完全敲除）（图A）。

两种三阳性小鼠模型（图B）。

研究发现

Serpine2在野生型小鼠和Serpine2条件过表达（cOE）小鼠中的表达

图1

检测野生型小鼠出生后耳蜗发育过程中Serpine2的表达动态：

提取野生型小鼠出生后第3、7、14、21和30天耳蜗组织的RNA和蛋白（图1A）。

Serpine2在转录水平（图1B）和翻译水平（图1C）均于出生后各阶段持续表达，且随小鼠年龄增长呈现显著下降趋势，这一变化与耳蜗祖细胞干性维持的时间窗口一致。

探究Serpine2是否在体内影响毛细胞再生：

通过 CRISPR/Cas9 技术在Hipp11（H11）位点插入包含Serpine2基因序列和3×HA标签的载体，构建Serpine2loxp/+转基因小鼠（图1D），并鉴定基因型（图1E），P1阶段通过腹腔注射他莫昔芬诱导Cre酶切除loxP位点间STOP终止子，实现Serpine2 cOE组小鼠基底膜（BM）的Serpine2过表达（图1F）。

RT-qPCR结果显示，与对照组相比，Serpine2 cOE组小鼠耳蜗中Serpine2表达量显著升高，且呈现剂量依赖性增加（图1G）。Lgr5+祖细胞中HA标签的特异性染色证实Serpine2在Lgr5+祖细胞中成功过表达（图1H，Myosin7a 用作 HC 标记）。

杂合型Serpine2 cOE小鼠的异位IHCs增加

图2

以杂合型Serpine2条件过表达小鼠（Lgr5EGFP-CreER/+Serpine2loxp/+）作为实验组，以Lgr5EGFP-CreER/+小鼠（排除 CreER 和他莫昔芬的影响）和Serpine2loxp/+小鼠（排除 loxP 插入和他莫昔芬的非特异性效应）作为对照组，小鼠耳蜗于P7时取材进行成像分析（图2A）。

在杂合型Serpine2 cOE小鼠耳蜗中观察到大量异位毛细胞（图2B，用箭头表示IHC，方括号表示OHC）。

内毛细胞（IHCs）：杂合型Serpine2 cOE小鼠耳蜗中异位IHCs总数较Serpine2loxp/+对照组增加超过3倍，与Lgr5EGFP-CreER/+对照组无显著差异（图2C-D）；从基底转向顶端转呈现递增趋势，三个耳蜗转的异位IHCs数量分别达到Serpine2loxp/+对照组的2倍、4倍和16倍（图2B-C）

外毛细胞（OHCs）：杂合型Serpine2 cOE小鼠的异位HCs数量与两个对照组均无显著差异（图2E-F）

纯合型Serpine2 cOE小鼠的异位 HCs 显著增加

图3

将Serpine2loxp/loxp小鼠与杂合型Serpine2 cOE小鼠交配获得纯合型Serpine2 cOE小鼠（Lgr5EGFP-CreER/+Serpine2loxp/loxp），以Lgr5EGFP-CreER/+小鼠和Serpine2loxp/+小鼠作为对照组，小鼠耳蜗于P7时取材进行成像分析（图2A）。

内毛细胞（IHCs）：与Lgr5EGFP-CreER/+及Serpine2loxp/loxp对照组相比，纯合型Serpine2 cOE小鼠的异位内毛细胞（IHCs）数量显著增加超5倍（图3B-D）；在 Serpine2loxp/+小鼠、杂合型Serpine2 cOE小鼠、纯合型Serpine2 cOE小鼠中，异位IHCs数量呈现梯度增长（基底转→中转→顶转递增趋势）（图3G-H）。

外毛细胞（OHCs）：纯合型cOE小鼠异位OHCs数量较两个对照组均显著增加，总量提升至少3倍（图3B，E，F）；在Lgr5EGFP-CreER/+小鼠、杂合型Serpine2 cOE小鼠、纯合型Serpine2 cOE小鼠中，顶转异位 OHC 的数量有增加趋势（图3I-J）。

异位OHCs与IHCs数量随Serpine2表达水平升高而增加，证实Serpine2通过剂量依赖性方式促进毛细胞再生。

在 Serpine2 cOE 小鼠中未观察到 lgR5 + 祖细胞的增殖

图4

杂合型和纯合型Serpine2 cOE小鼠于P1时腹腔注射他莫昔芬，并于P3-P5连续注射EdU（标记增殖细胞），Lgr5EGFP-CreER/+小鼠作为对照组（图4A）。

在杂合/纯合型Serpine2 cOE小鼠及对照组耳蜗中，均未检测到EdU+支持细胞（图4B-E，Sox2 用作支持细胞标记物）。

异位毛细胞并非通过有丝分裂途径再生，提示Serpine2可能通过直接转分化机制驱动毛细胞再生。

Serpine2 cOE 通过诱导 Lgr5+ 祖细胞的直接转分化促进 HC 再生

图5

图S2

图S3

构建两种三阳性小鼠模型（Lgr5EGFP-CreER/+Serpine2loxp/+Rosa26-tdTomato和 Lgr5EGFP-CreER/+Serpine2loxp/loxpRosa26-tdTomato）用于谱系追踪，Lgr5EGFP-CreER/+Rosa26-tdTomato 小鼠作为对照组，P1腹腔注射他莫昔芬激活Cre酶，P7观察并定量 Myosin7a+tdTomato+双阳性毛细胞（图5A）。

EdU阴性和谱系追踪阳性双重验证Serpine2条件过表达通过直接诱导Lgr5+祖细胞转分化而非有丝分裂再生来促进毛细胞再生（尤其是内毛细胞）：与对照组相比，杂合型三阳性小鼠耳蜗顶转tdTomato+IHCs数量较对照组增加至少2倍，纯合型三阳性小鼠耳蜗顶转tdTomato+IHCs数量较对照组增加至少3倍，仅在纯合型小鼠中观察顶转和中转tdTomato+OHCs数量明显高于对照组（图5B-H及图S2A-C）。

P30小鼠的听觉脑干反应测试显示，Serpine2过表达对听力功能无显著影响（图S3A-C）。

Serpine2敲低在体外和体内实验中均能抑制新生小鼠毛细胞再生

图6

图S4

体外实验：

通过HEI-OC1细胞系筛选出敲低效率最优的siRNA-Serpine2-1243（siRNA-Ser）（图S4A-B），将siRNA-Ser转染至P1阶段的Lgr5EGFP-CreER/+Rosa26-tdTomato小鼠的耳蜗外植体中，并在培养4天后对tdTomato+毛细胞进行定量分析（图6A）。

顶转和中转的tdTomato+毛细胞数量分别减少至少1.5倍和1.9倍（图6B-D）；蛋白水平验证敲低效率（图S4C-D）。

体内实验：

基于siRNA-Ser序列构建pAAV2-shRNA质粒（图S4E），包装为AAV-内耳病毒（AAV-Sh-Ser），P1小鼠腹腔注射他莫昔芬，P2经圆窗膜注射AAV-Sh-Ser，P7检测（图6E）。

耳蜗顶转tdTomato+毛细胞数量显著减少（图6F-H）；蛋白水平（图S4F-G）和免疫荧光（图S4H-I）验证体内敲低效率。

Serpine2 cOE 小鼠耳蜗的单核转录组学分析

图7

表S5

图S5

单核转录组分析表明Serpine2 cOE可能通过抑制SHH通路并激活Atoh1和Pou4f3诱导毛细胞再生：

细胞类型鉴定：

成功捕获对照组（Serpine2loxp/loxp）5,846个和Serpine2 cOE组（Lgr5EGFP-CreER/+Serpine2loxp/loxp）7,725个单核转录组。基于已知标记基因表达，鉴定出两组中的主要细胞类型，包括外毛细胞（标志基因Slc26a5）、内毛细胞（标志基因Slc17a8/Atp2a3/Otof）及各类支持细胞（图7A,B,D,E）。毛细胞比例在对照组和cOE组分别为5.87%和7.21%（表S5），与表型观察中Serpine2 cOE增加毛细胞数量的结果一致。

将一类高表达Lgr5及部分支持细胞标志的毛细胞亚群定义为未成熟毛细胞（iHCs）。Monocle2轨迹分析显示，cOE组中部分未成熟IHCs（iIHCs）和未成熟OHCs（iOHCs）位于IHC和OHC发育轨迹的中段（图7C,F），进一步支持Serpine2 cOE诱导毛细胞再生的结论。

基因与通路分析

针对目标Lgr5+细胞群（毛细胞、Deiters细胞、柱细胞、Hensen细胞、内缘细胞）的基因表达分析表明，cOE组Lgr5+细胞中Serpine2表达显著高于对照组（图7G）。对两组中的Lgr5+细胞进行了差异表达基因（DEGs）排序，对DEGs进行Metascape富集分析显示，这些基因参与分化与发育调控（如心肌细胞分化、Wnt通路等）（图S5）。通过regulon活性（AUC）评分评估发现，cOE组Lgr5+细胞中SHH通路活性降低而Wnt通路活性升高（图7H-M）。

结果验证：

RT-qPCR验证显示，cOE组中SHH通路抑制因子Hhip和Ptch1上调，而Smo、Shh和Gli2下调（图7O），与测序结果一致；但Wnt通路基因表达无显著差异（图7P）。此外，cOE组中毛细胞关键转录因子Atoh1和Pou4f3的mRNA水平显著升高（图7N）。

测序方法及数据分析：

单核转录组学分析（snRNA-seq）是一种基于单细胞分辨率的转录组测序技术，通过捕获单个细胞核的RNA来解析组织或细胞群体的基因表达异质性，克服了传统单细胞RNA测序（scRNA-seq）对活细胞样本的依赖，尤其适用于难以解离的固体组织（如脑、心脏、骨骼肌）或冷冻保存的样本。

Monocle2轨迹分析：一种通过单细胞RNA测序数据推断细胞发育轨迹或动态变化过程的生物信息学方法。Monocle2通过算法模拟细胞在“拟时间轴”上的变化顺序，推断其发育轨迹或状态转换路径。基于基因表达模式的相似性，将细胞按发育阶段排序，构建连续的分化轨迹，轨迹可能呈线性、分支或多分支结构，反映细胞亚型的分化命运。

差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）：指在两组样本（如对照组 vs. 实验组）中表达水平显著不同的基因。

富集分析（Enrichment Analysis）：将差异表达基因与已知功能数据库（如GO、KEGG、Reactome）比对，识别基因集在特定生物学过程、通路或细胞组分中的富集情况。

Regulon活性（AUC）评分：单细胞转录组分析中用于量化转录因子调控网络（Regulon）在单个细胞中活跃程度的指标。通过计算Regulon中所有基因在细胞中的表达量排序累积曲线下的面积，量化该调控网络在细胞中的活跃程度。

讨论

突破

创新性发现：首次证实Serpine2是毛细胞再生的新型调控因子，其过表达通过剂量依赖性方式增加异位毛细胞。

技术严谨：条件性过表达和敲低Serpine2，从正反两个方面探究机制；结合EdU实验、谱系追踪实验、snRNA-seq分析等多种技术手段；离体（siRNA）与体内（AAV-shRNA）实验结合。

转化潜力：Serpine2过表达未影响听力（ABR正常），AAV-ie载体已证明可用于内耳基因治疗，为临床提供潜在靶点。

局限性

机制深度不足：Serpine2与SHH通路的具体互作（如是否直接调控Gli2）需进一步验证；未解析Serpine2如何协同Atoh1/Pou4f3（共激活或间接调控？）。

模型限制：仅在新生小鼠中验证，成年哺乳动物毛细胞再生能力是否可被Serpine2激活尚不明确；未评估再生毛细胞的功能成熟度（如电生理特性）。

技术挑战：AAV递送效率在耳蜗不同区域存在差异（顶转＞基转），需优化靶向性。

汇报人：肖瑶

导师：赵宇

审核：程丹妮、任建君