华西耳鼻喉学术前沿速递——文献精读（第39期）
精读分享│【Frontiers in Public Health】：低辐射环境使过度生长诱导的细胞凋亡转向自噬
英文题目：Low Radiation Environment Switches the Overgrowth-Induced Cell Apoptosis Toward Autophagy
中文题目：低辐射环境使过度生长诱导的细胞凋亡转向自噬
期刊：Frontiers in Public Health (IF=5.2)
单位：意大利格兰萨索国家实验室
时间：2021年1月12日
引言:
低剂量辐射可影响和调节细胞对各种应激刺激的反应，导致细胞对损伤的抵抗力或敏感性发生紊乱。为了探索在环境辐射暴露下发生的可能机制，建立了两个生物模型，一个在意大利格兰萨索国家实验室的低辐射环境（LRE）实验室中生长，另一个在意大利国家卫生研究所（ISS）的参考辐射环境（RRE）实验室中生长。研究是在pKZ1A11小鼠杂交瘤细胞上进行的，该细胞来自用于研究低剂量辐射影响的pKZ1转基因小鼠模型，重点分析细胞/分子终点，如增殖和参与应激反应、细胞凋亡和自噬的关键蛋白的表达。在LRE中培养长达4周的细胞与在RRE中培养的细胞相比，增殖率没有明显差异。然而，在RRE中进入过度生长状态的细胞中观察到了Caspase-3活化和PARP1裂解，这表明生长应激条件触发了细胞凋亡。值得注意的是，在LRE条件下，细胞通过转向自噬来应对生长压力。有趣的是，LRE中过度生长诱导的自噬信号与p53的激活有关。最后，环境辐射中的γ成分对这些生物反应没有显著影响，因为在有或没有铁屏蔽的培养箱中生长的LRE细胞不会改变它们的反应。总体而言，本文提供的体外数据表明，环境辐射有助于生物体平衡和防御反应的发展和维持。
总体研究思路：
主要结果：
1、细胞培养流程
为了评估LRE对细胞增殖和应激诱导细胞死亡等细胞行为的影响，选择pKZ1 A11杂交瘤细胞系作为模型，并在罗马国际空间站的RRE实验室进行培养（图1）。细胞增殖曲线在24~72h呈线性增长，96h出现拐点，123h达到平台期。裂解的PARP1作为细胞凋亡标志物，呈时间依赖性增加，96h后达到高峰，此时细胞开始进入增殖平台期，并开始处于过度生长应激状态，这是由于营养和生长因子剥夺、培养液pH变化、较高的需氧量和消耗造成的（图2）。这些数据表明，在RRE中，pKZ1A11细胞容易在过度生长应激条件下通过凋亡启动和进展。
图 1. 细胞培养流程
图 2. pKZ1 A11小鼠杂交瘤细胞生长条件设置
2、低本底辐射环境下过度生长诱导的细胞凋亡转向自噬
为了评估可能由于环境辐射水平而存在的差异行为，pKZ1 A11细胞在LRE和RRE中平行维持4周，观察到在RRE和LRE中生长的细胞的增殖速率没有显著差异。此外，为了评估RRE对在LRE中培养1个月的细胞的影响，将LRE中生长4周的pKZ1 A11细胞移至RRE实验室并再培养两周（图3A，第5周和第6周）。在增殖方面没有观察到差异。这些数据表明，LRE不影响pKZ1 A11 细胞的细胞生长行为。
在线性生长72h条件下，RRE和LRE中PARP1的表达和裂解行为相似。与RRE培养的细胞相比，LRE中过度生长的细胞(96h)中检测到较低水平的PARP1裂解形式。与RRE相比，LRE中的PARP1裂解蛋白减少约一半。当地下培养4周后，将细胞转移到RRE实验室再培养2周时，这种效应出现逆转，表明细胞对低本底环境辐射的反应是可塑性的（图3B、C）。
图 3. 低辐射环境对pKZ1 A11小鼠杂交瘤细胞增殖和过度生长诱导细胞凋亡的影响
为了进一步阐明在LRE中培养的过度生长细胞与RRE的分子反应，对已知与细胞应激反应有关的蛋白质进行了蛋白质印迹分析。在因过度生长（培养96小时）而受到应激刺激后，LRE和RRE培养细胞之间的HSP70（细胞应激反应有关的蛋白质）水平没有差异；总p53（基因组稳定性控制和细胞死亡调节）水平没有显著调节，而p53的活性形式（以Ser15和Ser392的磷酸化评估）在LRE过度生长条件下得到强烈诱导，活性p53的表达与LC3B-Ⅰ转化为迁移率较低的LC3B-II（自噬标志物）相关，表明在LRE条件下，细胞对过度生长应激的反应是转向自噬；最后，根据 PARP1 裂解数据，通过caspase 3（自噬标志物）诱导证实了RRE过度生长细胞中的细胞凋亡诱导（图4）。这些数据表明了在低本底辐射环境下长期细胞培养引起的压力/损伤的反应和防御的替代机制。
图 4. 低辐射环境将 pKZ1 A11 小鼠杂交瘤过度生长细胞反应从细胞凋亡转变为自噬
3.辐射成分γ射线不影响LRE过度生长细胞反应
在LRE中进一步设立两个孵箱，差异为有无铁屏蔽，有铁屏蔽体可以降低伽马射线到原有的1/4，以研究伽马射线的作用。pKZ1 A11细胞的增殖在两种条件下非常相似。此外，在存在或不存在铁屏蔽的情况下，观察到磷酸化-p53、PARP1 裂解和caspase 3激活以及LC3-II诱导出蛋白表达差异（图5），表明γ成分在这种细胞反应和行为中的作用可以忽略不计。
图 5. γ辐射不影响pKZ1 A11小鼠杂交瘤细胞在低辐射环境中对过度生长的反应
讨论：
研究结果显示低本底环境辐射（格兰萨索国家实验室）的条件下活化p53介导的凋亡转向自噬，而不是在正常辐射环境中观察到的细胞凋亡反应。这让作者假设地球表面的环境辐射水平可能代表一种组成性低水平应激，能够使细胞在不同的急性应激情况下迅速做出反应，而在凋亡诱导不充分的情况下，DNA损伤可能会进一步扩散。
汇报人：郝智贞
导师：刘峰、刘吉峰
审核：宋瑶、任建君
