四川大学华西医院耳鼻咽喉头颈外科 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery at West China Hospital, Sichuan University.

华西耳鼻喉学术前沿速递——文献精读（第105期）

发布时间：2026-03-29

精读分享│【JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH】：头颈部肿瘤类器官生物样本库：基于TP53/HPV状态建立个体化放疗反应预测模型

英文题目：Head and neck tumor organoid biobank for modelling individual responses to radiation therapy according to the TP53/HPV status

中文题目：头颈部肿瘤类器官生物样本库：基于TP53/HPV状态建立个体化放疗反应预测模型

期刊：JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH（IF: 12.8）

单位：德国法兰克福歌德大学、Georg-Speyer-Haus肿瘤生物学和实验治疗研究所等机构合作发表

发表时间：2025年3月

摘要：

背景：

头颈癌（HNC）是一组异质性极高的疾病，治疗结果难以预测。患者来源的肿瘤类器官（PDTO）为个体化治疗测试和深入了解主要HNC驱动因素提供了巨大的潜力。

方法：

该研究建立了头颈类器官生物库（HNOB），该生物库对TP53突变体和人乳头瘤病毒16型（HPV 16）感染驱动的HNC临床相关亚型进行了分子和功能表征。将类器官暴露于放疗，其反应与临床数据相关联。基因工程正常类器官和肿瘤类器官用于测试TP53缺失和HPV感染的直接功能后果。

结果：

生成了由18个类器官模型组成的HNOB，其中包括15个肿瘤模型。确定了亚型相关的转录组学特征和病理特征，包括MDM2抑制剂Nutlin-3对TP53稳定的敏感性。此外，描述了一种体外放射反应测定，揭示了与个体患者的治疗结果相关的表型异质性，包括复发概率。使用基因工程类器官，证实了两种癌症驱动因素共存的可能性。TP53缺失以及HPV感染均促进了正常和肿瘤类器官的生长。TP53功能丧失本身不足以促进辐射抵抗，而HPV 16癌基因E6/E7通过诱导细胞周期停滞介导放射敏感性。

结论：

该研究结果强调了头颈类器官模型的转化价值，不仅对患者分层具有重要意义，而且对特定癌症驱动因素的治疗反应性的机制验证具有关键作用。

研究思路及方法：

主要结果：

1.类器官生物库概括了 HNC 的分子和表型特征

为建立头颈部类器官生物库（HNOB），该研究从14名患者（8男6女）中建立了15个肿瘤类器官，这些患者处于不同病期、具有不同实体类型和病灶部位，涵盖了主要头颈部鳞状细胞癌亚型。其中一个PDTO（O02T）源自腺癌（Fig. 1a, b; Supplementary Fig. S1a）。rO08T源自舌癌早期复发病例，该病例在接受舌部部分切除术后三个月复发，且未对原发肿瘤O08T进行辅助治疗。除经新辅助化放疗（CRTx）后采集的O12T外，其余所有类器官均通过术前未接受治疗的标本经手术切除获得。此外，从切除标本中未受影响的肿瘤邻近区域成功建立三个正常类器官系（Supplementary Fig. 1b）。采用Driehuis等（2019）优化的培养条件，类器官可实现长期扩增（>15代）。类器官呈现指数增长，平均每7-14天传代一次（Supplementary Fig. S1c）。除O11T和O11N呈现囊性表型外，其余均保持特异性形态学特征，主要表现为致密上皮结构（Fig. 1c; Supplementary Fig. S1a, b; S2）。

Figure 1. Clinical and genetic characteristics of head and neck cancer organoid biobank.

Figure S1. HNSCC organoid morphology and expansion.

Figure S2. Hematoxylin and eosin staining of HNSCC organoids.

为进行基因组特征分析，对10份PDTO样本及其对应肿瘤组织进行了全外显子组测序（WES）。PDTO与肿瘤组织间单核苷酸多态性（SNP）的比对显示整体一致性良好（63.4±26.2%），其中肿瘤特异性SNP占比（13.3±9.2%）与PDTO特异性SNP占比（23.2±18.1%）相当（Fig. 1d）。总体而言，多数检测到的变异为影响C＞T转化的错义突变（Supplementary Fig. S3a, b），这与先前对HNSCC的研究结果一致。复发性突变的检测证实了已知驱动基因的存在（Fig. 1e）。如预期所示，TP53是突变频率最高的基因（15个PDTO样本中有10个携带突变）。检测到两种常见功能缺失变异：TP53R248Q（存在于O01T、O03T、O04T；O05T、rO08T、O09T、O10T、O12T及O13T）和TP53A138V（存在于O08T和O13T）（Supplementary Fig. S3c）。R248Q突变影响DNA结合区域，导致p53四聚体无法激活靶基因。TP53A138V则为罕见且临床报道较少的变异。TTN和FAT1突变（15例中有8例）始终与TP53突变共同存在。这三种突变均与高危亚型头颈鳞状细胞癌相关。根据TP53状态，检测到的肿瘤突变存在显著差异（p=0.033），这与p53在维持基因组完整性中的关键作用相符（Fig. 1e; Supplementary Fig. S3d）。与之相符的是，将两个类器官系O08T与早期复发系rO08T进行并列比较时，检测到的突变数量显著增加。一致性分析显示O08T与rO08T之间存在33.2%的共享突变。O08T具有29.5%的专属突变，rO08T则具有37.3%的专属突变，表明治疗过程中发生了遗传学转变。

Figure S3. Characterization by whole exome sequencing (WES) and RNA sequencing.

2.基于TP53和HPV状态的类器官生物库功能分类

为确保病理亚型分类的一致性，根据TP53和HPV状态对PDTO样本进行分析。p53免疫组化染色显示11例PDTO呈阳性，其中10例经全外显子组测序（WES）验证（Supplementary Fig. S4a）。与TP53野生型PDTO相比，TP53突变型PDTO的p53染色水平显著更高（Supplementary Fig. S4b）。通过WES检测到的TP53突变在9份PDTO样本中有8份得到转录组水平验证（Fig. 1e, f; Supplementary Fig. S3e）。在O10T细胞系中，第3代培养物经WES检测发现TP53突变，但第6代培养物经p53免疫组化及RNA测序未能确认该突变，表明长期培养过程中发生基因型漂移并伴随表型改变（Fig. 1e, f; Supplementary Fig. S1）。

所有PDTOs的HPV状态通过替代标志物p16的免疫组化染色、扩增子杂交法基因分型（VisionArray）、全外显子组测序（WES）及RNA测序确定（Fig. 1f; Supplementary Fig. S5）。在组织中，扩增子杂交法可检测到HPV 16、HPV 33和HPV 35，但在PDTO中仅发现HPV 16，且所有来自正常邻近组织的类器官均为HPV阴性。值得注意的是，扩增子杂交法显示部分细胞系呈阳性，但免疫组化或测序无法确认，表明存在假阳性结果（Fig. 1f）。

综合分析结果，共分类出9个TP53突变型和3个HPV阳性PDTO，其发生模式如先前所述呈互斥关系。此外，另有两份PDTO（O11T和O14T）被归类为HPV阴性且TP53野生型（Fig. 1f）。这些结果表明，通过对肿瘤组织和PDTO进行组织学与分子学联合分析，可提高病理评估的准确性。

Figure S4. p53 immunohistochemistry of HNSCC organoids.

Figure S5. p16 immunohistochemistry in HNSCC organoids as HPV surrogate marker.

3.TP53缺失和HPV+ PDTOs呈现特征性转录组学特征

针对PDTOs的转录组测序采用批量RNA测序技术。相关性分析、无监督层次聚类及主成分分析揭示出TP53突变体（区分TP53R248Q与TP53A138V突变）与HPV+类器官的独立聚类（Fig.2a; Supplementary Fig.3e）。腺癌细胞系（O02T）与TP53R248Q突变体呈现相似性。未观察到基于解剖位置的聚类现象。随后对HPV阳性与TP53R248Q突变PDTOs进行差异基因表达分析（Fig.2b）。基因集富集分析（GSEA）显示，TP53突变与促炎标志性特征（TNF/NF-κB信号通路、补体激活、移植物排斥反应）及上皮间质转化（EMT）显著上调相关，这些特征与HNSCC更恶性的表型相关（Fig.2c）。此外，HPV阳性PDTOs呈现已知HPV特征性表达模式，包括KRAS信号通路下调（Fig.2d）及谷胱甘肽转移酶上调——该酶此前被报道为E7诱导的促生存程序标志物。

为评估细胞分化对基因表达的影响，在细胞分裂后第2天和第7天进行了RNA测序，随后进行差异基因表达分析（Fig.2e）。第2天时，基因集富集分析（GSEA）显示与增殖相关的特征显著富集（E2F靶基因、MYC靶基因、G2M检查点、干性及核糖体生物发生；Fig.2f）。相反，晚期时间点无论TP53/HPV状态如何，分化相关特征（包括缺氧和细胞外基质）均呈上调，表明HNSCC类器官具有显著的自发分化能力（Fig.2g）。

Figure 2. Transcriptomic characteristics of head and neck cancer organoid biobank.

4.HNOB显示出异质性生长特征，并对TP53稳定敏感

为进行功能表征，测定了类器官的形成与生长能力。在接种2000个单细胞并培养7天后，观察到显著的集落形成差异，且该差异与TP53/HPV状态无显著关联（Fig. 3a, b）。后续所有实验均对单细胞数量进行标准化处理，以获得可比性的类器官数量。通过144小时的RealTimeGlo™检测量化细胞增殖，结果显示各细胞系的细胞倍增时间相当（Fig. 3c）。由此证实，集落形成与生长能力属于亚型无关的特性。随后通过MDM2抑制剂Nutlin-3处理评估TP53活性。如预期，TP53突变型PDTO对Nutlin-3敏感性降低（Fig. 3d, e；p=0.004），验证了亚型分类结果。值得注意的是，低浓度和中等浓度的Nutlin-3在TP53R248Q PDTOs中反而导致ATP水平升高（Fig. 3d）。相反，TP53A138V PDTOs对Nutlin-3暴露表现出耐受性，但未出现ATP水平升高，表明TP53等位基因存在功能异质性——R248Q在适度稳定时会产生致癌效应。

Figure 3. Phenotypic characterization of the head and neck cancer organoid biobank.

5.个体放射反应的体外评估

在临床实践中，头颈部癌症患者对放射治疗的反应存在高度异质性。亟需建立临床前检测方法来研究这些差异并开展个体化治疗试验。在HNOB模型中，通过单次剂量照射（2至10 Gy；Fig. 4a）评估了放射反应（RR）。采用RealTimeGlo®检测法监测细胞存活率，并通过生长速率（GR）指标计算各细胞系生长差异，该指标与终点测量结果高度吻合（Supplementary Fig. S6a, b）。观察到两种特征性表型：高剂量下完全应答的细胞系，以及低剂量部分应答但高剂量下持续存活的细胞系（Fig. 4b）。曲线下面积（GRAOC）的量化显示各细胞系存在显著差异（Fig. 4c）。其中腺癌PDTO表现出高辐射耐受性，与临床观察一致。肿瘤类型或解剖位置与GRAOC无显著关联。但在临床实践中，将细胞系简明分类为高响应与低响应仍具重要意义。为此，该研究测定了模拟无限剂量下的GRinf值（Fig. 4d）。15个PDTO中有6个呈现正GRinf值，表明高剂量下仍持续生长，该指标被用作高危病例的分类指标。在14例HNOB患者中，10例在原发手术切除后接受了辅助放疗/化放疗，其中两名患者（P01、P08）在研究期间出现复发，二者GRinf值均为阳性，故被正确归类为高危患者。其余在类器官模型中被判定为低反应性的肿瘤均得以完整切除，且保留了较大安全切缘。在所有被归类为良好反应者组别中，至少两年的随访期间均未出现临床复发。综上所述，该实验揭示了RR的显著异质性与其个体化临床结局相关，表明该检测具有个性化应用价值。

Figure 4. Radioresponse (RR) of head and neck cancer organoid biobank.

Figure S6. Characterization and validation of the radiation response (RR) assay.

6.在正常与肿瘤类器官中模拟TP53突变与HPV感染

为研究肿瘤进展并评估TP53和HPV状态的直接影响，该研究建立了基因修饰方案。首先，在肿瘤邻近组织来源的正常类器官（O15N、O16N）以及TP53野生型且HPV阳性的肿瘤类器官（O07T）中研究了TP53缺失的影响。通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除（Supplementary Fig. S7a）或慢病毒导入TP53失活突变体R248Q（Supplementary Fig. S8a）实现TP53功能缺失。经Nutlin-3筛选确认TP53功能丧失，并通过Sanger测序验证Cas9诱导的插入缺失突变（Supplementary Fig. S7b）。剂量滴定实验显示Nutlin-3耐药性（Fig. 5a, b）。Western blot分析表明，p53表达在过表达时增加，但在Cas9修饰细胞系中仅轻微降低，表明诱导了可能不影响蛋白水平的异质性突变（Supplementary Fig. S7c, S8c）。然而Nutlin-3处理后p53靶基因p21的诱导水平降低，表明该通路存在功能缺陷。TP53缺失的正常类器官单细胞形成集落能力显著强于对照系（Fig. 5c, d）。多数肿瘤及正常类器官的细胞倍增时间均显著短于对照系（Fig. 5e, f）。GRAOC在正常与肿瘤类器官中均轻度下降，表明仅TP53缺失不足以赋予辐射抵抗性（Fig.5g, h）。

Figure 5. Genetic TP53 perturbations promote Nutlin-3 resistance and cell growth.

Figure S7. Modelling the TP53 status by CRISPR/Cas9 knock out in normal and tumor head and neck organoids.

Figure S8. Lentiviral expression of a dominant negative TP53 variant in normal and tumor head and neck organoids.

为探究HPV感染的表型后果，采用慢病毒策略（Supplementary Fig. S9a）将高危型HPV 16的致癌基因E6和E7导入两条HPV基因分型阴性的正常组织类器官系（O11N、O15N）。此外，采用TP53突变型（HPV阴性）肿瘤类器官（O04T、O08T、O09T）研究两种驱动基因共同存在的效应——此前研究表明这两种基因极少同时存在。通过RNA测序验证了E6/E7的过表达。与正常类器官不同的是，在三种肿瘤类器官中有两种，E6/E7显著促进了其集落形成（Fig. 6a）并缩短了细胞倍增时间（Fig. 6b）。E6/E7表达后类器官体积普遍增大（p=0.052）（Fig. 6c）。Nutlin-3敏感性未见一致性改变（Fig. 6d），表明E6介导的TP53不稳定化机制在口腔上皮原代细胞中不具主导作用。然而，与TP53状态工程化观察结果相似，E6/E7过表达证实了两种驱动因子可能同时存在的可能性。

接下来，该研究探究了HPV对RR的影响。剂量滴定显示，正常细胞系及3个肿瘤细胞系中的2个均呈现显著增强的敏感性（GRAOC）（Fig. 6e,f）。为探究其作用机制，通过PI/Hoechst染色及共聚焦成像测定了活/死细胞比例（Supplementary Fig. S9b, S9c）。经6 Gy单次剂量照射后，观察到E6/E7表达与正常细胞（O11N）和肿瘤类器官（O08T）中死亡细胞比例的持续增加相关，或导致O04T细胞在辐射暴露中的恢复能力明显下降（Fig. 6g）。仅在E6/E7表达未赋予放射敏感性的O09T细胞中，未观察到细胞死亡的明显影响。随后通过DAPI和KI67免疫染色结合流式细胞术分析细胞周期分布（Supplementary Fig. S9a-d）。在无辐射条件下，E6/E7表达细胞系未见细胞周期变化。然而，经6 Gy辐射24小时后，辐射敏感细胞系的G2期细胞比例显著升高（Fig. 6h）。辐射后72小时及120小时，所有细胞系均恢复至基线细胞周期分布，表明存在由E6/E7介导的暂时性G2期阻滞。